Туйчибоева М.Н., Мурадов А.М., Шукуров Т., Шумилина О.В.

Курс «Лабораторное дело» ТИППМК

Ключевые слова: эндотоксикоз, токсичные компоненты крови, молекулы средних масс, гель-хромотография, ИК-спектрометрия

Одной из наиболее актуальных проблем в структуре современной соматической патологии остается эндотоксикоз, являющийся базисным компонентом формирования тяжести общего состояния. В статье приведены результаты анализа токсичных компонентов крови 206 боль­ных эндотоксикозами, которые развились в результате острой почечной недостаточности, перитонита и сепсиса в сравнении с показателями 20 практически здоровых доноров. Мате­риалом для исследования служила кровь пациентов в возрасте от 17 до 62 лет, из которых мужчины составили 59,3%, женщины — 40,3%. В исследовании использовались биохимические, гель-хроматографические и ИК-спектроскопические методы диагностики показателей марке­ров, отражающими уровень интоксикации. Установлено, что индекс токсичности у больных эндотоксикозами возрастает более чем на 700%, по сравнению с контролем. На основании проведенных исследований можно резюмировать, что у больных эндотоксикозами проис­ходят интенсификация перекисного окисления липидов, угнетение иммунитета, снижение антиоксидантной защиты и детоксикационной способности организма. Сравнение кривых фракционирования плазмы крови при эндотоксикозах и у здоровых лиц показало, что у больных основной группы происходит значительное увеличение фракций А и В, в меньшей степени фракции В. Наблюдалась тенденция к снижению в крови уровня молекулы средней массы вследствие их концентрационного перераспределения, которое может быть характер­ным только для эндотоксикоза.

Tuychiboeva M.N., Muradov A.M. Shukurov T., Shumilina O.V.

COMPARATIVE EVALUATION OF EFFICIENCY APPLICATION OF MODERN METHODS OF DIAGNOSTICS TOXIC BLOOD COMPONENTS DURING ENDOTOXEMIA

Course "Laboratory work" TIPGPMP

Key words: endotoxicosis, intoxication, average molecular weight, gel chromatography, infrared spectroscopic

One of the most urgent problems in the structure of modern somatic pathology remains endo­toxicosis, which is a basic component of the formation of the severity of the General condition. The article presents the results of analysis of toxic blood components 206 patients endotoxemia developed in the result of acute renal failure, peritonitis and septicemia in comparison with the figures of 20 healthy donors. Material for the study served as the blood of patients aged from 17 to 62 years, of which men made up 59,3% of women — 40,3%. The study used biochemical, gel-chromatography and infrared spectroscopic methods of diagnostics indicators token to reflect the level of intoxication. Found that the toxicity index in patients endotoxemia increases by more than 700%, compared with the control. On the basis of carried out research we can conclude that the patients endotoxemia occur intensification of lipid peroxidation, depression of immunity, reduction in antioxidant protection and detoxification abilities of organism. The comparison of the curves fractionation of blood plasma during endotoxemia and in healthy people showed that the patients of the main group there was a significant increase in fractions of A and D, to a lesser extent faction Century There was a tendency to a decrease in blood levels of medium-weight molecules due to their concentration redistribution that may be characteristic only for endotoxicosis

Актуальность

Эндотоксикоз (эндогенная интоксикация) остается одной из наиболее актуальных про­блем в структуре современной соматической патологии [3, 6, 7]. У больных реаниматоло­гического профиля эндотоксикоз является ба­зисным компонентом формирования тяжести общего состояния, уровень летальности при этом достигает 90% [7].

Эндогенная интоксикация представляет собой синдром, характеризующийся нако­плением в тканях и биологических жидкостях организма избытка продуктов нормального или извращенного обмена веществ или кле­точного реагирования — эндогенных токси­ческих субстанций.

Очень важными и малоизученным направ­лением в проблеме эндотоксикоза продолжа­ют оставаться вопросы ранней его диагности­ки и определения степени тяжести, которые на сегодняшний день являются весьма актуаль­ными, так как определяют своевременность выбора лечения и результаты исхода [1].

Общая летальность даже в крупных, хоро­шо оснащённых клиниках не опускается ниже 24-35% при первой степени интоксикации, при второй степени — 60-70%, а при развитии у пациента полиорганной недостаточности достигает 80-90%.

Затраты на лечение одного пациента с эндотоксикозом в период нахождения в от­делении реанимации и интенсивной терапии в 6 раз выше стоимости лечения больного с другим вариантом критического состояния и составляют в развитых странах Америки и Европы от 15000 до 100000-300000 долларов США.

Это побудило нас провести анализ сущест­вующих методов диагностики показателей эн-дотоксикоза при различных реанимационных патологиях (перитонит, острая почечная недо­статочность, сепсис) в зависимости от степени проявления интоксикации с использованием биохимических, гель-хроматографических и ИК-спектрометрических методов, а также провести их сравнительную оценку с позиций информативности, экспресности, доступности и экономичности.

Рассматривая эндотоксикоз, как один из главных составляющих воспалительно-деструктивного патологического процесса в организме, необходимо признать, что на сегодняшний день клиническое изучение проявлений и стадий этого синдрома крайне недостаточны, также как и отсутствие единых методик диагностики, особенно на ранних стадиях заболевания.

Иммунная система человека представляет собой сложную многокомпонентную систему из быстроделящихся и покоящихся клеток. Она является высокочувствительной к воздействию токсинов, которая приводит к нарушению иммунорегуляторных процессов.

К настоящему времени достаточно под­робно изучено биологическое действие МСМ. Многие из них обладают нейротоксической активностью, угнетают процессы биосинтеза белка, способны подавлять активность ряда ферментов, разобщают процессы окисления и фосфорилирования, нарушают механизмы регуляции синтеза адениловых нуклеотидов, изменяют транс­порт ионов через мембраны, эритропоэз, фагоцитоз, микроциркуляцию, лимфодинамику, вызывают состояние вторичной иммунодепрессии. Среднемолекулярные пептиды (СМП) способны соединяться и блокировать рецепторы любой клетки, неа­декватно влияя на её метаболизм и функции. Показана возможность влияния МСМ на тонус гладкомышечных клеток, на трансваскулярный транспорт. Эти вещества могут взаимодействовать с компонентами систем гемостаза. Считается, что МСМ могут про­никать даже через плацентарный барьер, оказывая непосредственное токсическое влияние на плод, вызывая полиорганные нарушения разного характера. Токсическое влияние могут оказывать накапливающиеся в нефизиологических концентрациях проме­жуточные и конечные продукты нормаль­ного и нарушенного обмена. Диагностиче­ское значение этих веществ велико как при воспалениях разного характера, так и при токсикозах разного происхождения.

Наиболее показательными и информатив­ными маркерами состояния прооксидантно-антиоксидантного равновесия организма, которые при усилении действия на организм токсинов смещаются в сторону активизации перекисного окисления липидов (ПОЛ) в крови, являются низкомолекулярные фрак­ции — мочевина и креатинин, амфифильные вещества — малоновый диальдегид (МДА) и супероксиддисмутаза (СОД)), гидрофильные токсины — молекулы средней массы (МСМ), некротические тела (НТ), циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), общая и эф­фективная концентрации альбумина (ОКА и ЭКА), интегральные показатели — тест времени выживания парамеций (ВП), лей­коцитарный индекс интоксикации (ЛИИ), индекс интоксикации (ИИ), индекс токсич­ности (ИТ).

Таким образом, на сегодняшний день ин­токсикацию организма рассматривают как один из наиболее важных критериев, опреде­ляющих тяжесть состояния человека.

Цель исследования

Изучить особенности и возможности лабораторной диагностики основных по­казателей токсичных компонентов крови больных эндотоксикозами при разных реа­нимационных патологиях биохимическими, гель-хроматографическими и ИК-спектрометрическими методами, выявить их корре­ляционные связи со степенью интоксикации организма, провести их сравнительную оценку с позиций эффективности, опера­тивности, информативности, доступности и экономичности.

Материал и методы исследований

8 исследованиях применялись биохимиче­ские методы исследования токсичных компо­нентов крови:

9 Определение малонового диальдегида (МДА) с тиобарбитуровой кислотой (методом Конюхова В.С., 1989);

9 Определение активности каталазы (мето­дом Королюка М.А., 1988);

9 Определение общего холестерина в сы­воротке крови (Ферментативным методом Творогова М.Г., 1995);

9 Определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в крови (методом Гриневича Ю.А., 1988);

9 Определение уровня молекул средних масс (МСМ) в крови (спектрометрическим методом Габриэлян Н.И., 1985);

9 Определение показателей эффективной концентрации альбумина (ЭКА) и общей концентрации альбумина (ОКА) в сыворотке крови (Флуоресцентным методом Миллера Ю.И., 1994);

9 Тест выживания парамеций (ВП) (мето­дом Пафомова Г.А., 1990);

9 Определение лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ) (рассчитывают по фор­муле Кальф-Калифа Я.Я., 1941);

9 Определение индекса интоксикации (ИИ) (методом Гринёва М.В., 1989);

9 Определение индекса токсичности (Ит) (рассчитывают по формуле Грызунова Ю.А. и Добрецова Г.Е., 1994).

Также в исследованиях использовались ме­тоды высокоэффективной гель-хроматографии и молекулярной ИК-спектроскопии.

Базой для проведения исследований слу­жили: центральная биохимическая лаборато­рия Городского научного центра реанимации и детоксикации (ГНЦРД) г. Душанбе; лабо­ратория молекулярных соединений институ­та химии им. В.И.Никитина Академии наук Республики Таджикистан и лаборатория мо­лекулярной спектроскопии Физико-техниче­ского института им. С.У.Умарова Академии наук Республики Таджикистан.

Материалом для исследования служила кровь 226 пациентов в возрасте от 17 до 62 лет, из которых мужчины составили 134 (59,3%), женщины — 92 (40,3%) больных. Сре­ди всех обследованных в качестве контроля была отобрана группа практически здоровых добровольцев из 20 человек разного пола в возрасте от 20 до 60 лет, из которых мужчины составили — 10 (50%) и женщины — 10 (50%) доноров.

По возрасту все обследованные составили: моложе 20 лет — всего 13 (5,8%) пациентов (8 (61,5%) мужчин и 5 (38,5%) женщин); от 20 до 40 лет — всего 73 (32,3%) пациентов (45 (61,6%) мужчин и 28 (38,4%) женщин); от 40 до 60 лет — всего 130 (57,5%) пациентов (75 (57,7%) мужчин и 55 (42,3%) женщин); старше 60 лет -всего 10 (4,4%) пациентов (6 (60,0%%) мужчин и 4 (40,0%) женщины).

Распределение обследованных больных эндотоксикозами по срокам госпитализации было следующим: в сроки от 24 до 36 часов поступило 26 (12,6%) пациентов, от 36 до 48 часов — 73 (35,4%) обследованных, от 48 до 72 часов — 62 (30,1%) больных и позже 72 часов поступило 45 (21,9%) больных.

Распределение больных эндотоксикозами представлено на диаграммах: по полу на рис. 1, по основной патологии на рис. 2, по возрасту на рис. 3 и по срокам поступления на рис. 4.

С целью проведения более корректного анализа все обследованные были подвергнуты рандомизации по возрасту, по срокам посту­пления и по основным патологиям (рис.5), в результате которых развился эндотоксикоз.

Для всех исследований бралась венозная кровь и отделялась сыворотка крови. Кровь бралась из локтевой вены преимущественно натощак в количестве не менее 5 мл. Центри­фугировалась при 1500 об/мин в течение 10 минут. При выполнении анализов сыворотка крови использовалась сразу или заморажива­лась и хранилась при 1 = -20^о С для последу­ющего исследования.

Рис. 5. Распределение обследованных после рандомизации

Для оценки выраженности токсемии и контроля за динамикой её развития использо­вались показатели крови: низкомолекулярных фракций — мочевина и креатинин, амфифильных веществ — МДА и СОД, гидрофильных

токсинов — МСМ, НТ, ЦИК, ОКА и ЭКА,

интегральные показатели — ВП, ЛИИ, ИИ, ИТ.

Вычисление коэффициентов корреляции и анализ корреляционных связей между измене­ниями индекса интоксикации (ИИ) организма больных эндотоксикозами и изменениями по­казателей основных маркеров интоксикации производили, применив математический метод и метод квадратов.

Статистическая обработка полученных данных включала подсчет среднеарифмети­ческих (М) значений и их ошибок (т), а также относительных величин (Х) и их ошибок (8х).

Расчет производился на компьютере, в опера­ционной среде Windows с применением пакета электронных таблиц EXCEL 7.0. Различие сравниваемых средних M±m принимались за достоверные при Р<0,05.

Результаты исследований и их обсуждение Нами было проведено исследование биохи­мических показателей токсичных компонентов: мочевина, креатинин, МДА, СОД, МСМ, НТ ЦИК, ПМ, ЛИИ, ИИ и Ит в крови 206 больных эндотоксикозами разной реанимационной пато­логии (ОПН — 88 (42,7%), перитонит — 72 (35,0%), сепсис — 46 (22,3%)) и 20 практически здоровых доноров в возрасте от 20 до 60 лет (табл. 1).

Сыворотка крови доноров была получена в биохимической лаборатории Городского научного центра реанимации и детоксикации (ГНЦРД) г. Душанбе.

Таблица 1

Показатели токсичности крови у здоровых и больных эндотоксикозами разной реанимационной патологии (М±т)

Показатели	Контрольная группа (n =20)	ОПН (n =88)	Перитонит (n = 72)	Сепсис (n = 46)
Мочевина, ммоль/л	4,8±0,4	16,4±1,2	14,8±1,2	14,1±0,9
Креатинин, мкмоль/л	103,7±3,7	261±12,5	290,5±11,3	235,3±13,9
1= 254 нм МСМ 1= 280 нм	0,180±0,02 0,218±0,03	1,294±0,03 1,600±0,04	1,263±0,05 1,573±0,07	1,450±0,07 1,790±0,03
МДА, нм в мл	60,4±2,3	130,2±0,6	119,8±3,6	145±0,7
СОД, усл. ед.	1,90±0,24	5,2±0,09	4,3±0,21	4,0±0,09
ЭКА, г /л	43,0±2,16	36,4±2,9	31,0±2,5	29,8±2,0
ОКА, г/л	50,0±3,8	39±2,6	36,0±2,8	33,0±2,1
Тест парамеций, мин.	21, 6±0,35	11,5±0,4	10,5±0,23	9,5±0,3
ЛИИ, усл. ед.	1,03±0,03	2,4±0,12	3,5±0,37	4,4±0,10
ИИ, усл. ед.	1,5±0,5	12,7±0,56	18,9±2,0	24,1±0,52
ИТ, усл. ед.	0,13±0,01	0,67±0,06	0,72±0,07	0,81±0,09

Примечание: Р<0,05 по отношению к контрольной группе.

Таблица 2

Показатели токсичности крови у здоровых и больных эндотоксикозами по стадиям интоксикации (М±т)

Показатели	Контрольная группа (n =20)	I степень (n =28)	II степень (n =54)	III степень (n = 101)
Мочевина, ммоль/л	4,8±0,4	9,0±0,8	12,8±1,2	14,8±1,2
Креатинин, мкмоль/л	90,7±3,7	108,6±10,5	171,4±10,2	209,5±11,3
1= 254 нм МСМ 1= 280 нм	0,180±0,02 0,218±0,03	0,35±0,018 0,38±0,02	0,46±0,02 0,47±0,02	0,6±0,022 0,62±0,023
МДА, нм в мл	60,4±2,3	96,4±2,1	119,2±3,2	130,8±3,6
СОД, усл. ед.	1,90±0,24	2,9±0,16	3,0±0,09	5,2±0,09
НТ, ед. в мл	5,9±0,24	31,0±2,1	42,6±2,1	53,2±2,2
ЦИК, усл. ед.	49±1,75	80,9±3,8	96,4±4,5	110,8±8,2
ЭКА, г /л	43,0±2,16	34,0±2,25	24,7±1,87	18,3±1,37
ОКА, г/л	50,0±3,8	42,3±3,1	33,7±2,21	24,5±1,52
Тест парамеций, мин.	21, 6±0,35	9,8±0,27	7,33±0,23	4,21±0,19
ЛИИ, усл. ед.	1,03±0,03	2,40±0,12	3,5±0,37	4,40±0,10
ИИ, усл. ед.	1,5±0,5	9,7±0,56	18,9±2,0	24,1±0,52
ИТ, усл. ед.	0,13±0,01	0,31±0,02	0,62±0,02	0,95±0,02

Примечание: Р<0,01 по отношению к контрольной группе.

 

Рис. 6. Изменение показателей низкомолекулярных фракций и амфифильных веществ крови больных эндотоксикозами в зависимости от степени интоксикации организма

Рис. 7. Изменение показателей гидрофильных токсинов в крови больных эндотоксикозами в зависимости от степени интоксикации организма

Показатели токсичности плазмы крови больных эндотоксикозами в зависимости от степени интоксикации представлены в табл. 2, а изменение показателей основных маркеров интоксикации – на диаграммах (рис. 6-9). Об уровне процессов ПОЛ обычно судят по концентрации вторичного продукта.

Так, у пациентов контрольной группы – практически здоровых доноров – показания мочевины составили 4,8±0,4 ммоль/л, а у больных эндотоксикозом III степени – 14,8±1,2 ммоль/л, т.е. возросли на 308,3%. Содержание креатинина в крови выросло с 90,7±3,7 мкмоль/л до 209,5±11,3 мкмоль/л, т.е. на 231%. Уровень МСМ у обследованных доноров в среднем составил 0,180±0,02 и 0,218±0,03 нм, при дли­нах оптических волн λ = 254 нм и λ = 280 нм, а у больных эндотоксикозами III степени — 0,6 и 0,62 нм соответственно. Рост составил порядка 300%. Показатели МДА выросли с 60,4±2,3 нм в мл до 130,8±3,6, т.е. на 215%, а показатели СОД с 1,90±0,24 до 5,2±0,09 усл. ед., на 274%. Увеличение некротических тел составило более 900%: с 5,9±0,24 до 53,2±2,2 ед в мл., а ЦИК с 49±1,75 до 110,8±8,2 усл. ед., т.е. 226%.

 

Рис. 8. Изменение интегральных показателей токсичности крови больных эндотоксикозами в зависимости от степени интоксикации организма

Рис. 9. Изменение показателей общей и эф­фективной концентраций альбумина в крови больных эндотоксикозами в зависимости от степени интоксикации организма

Показатели по альбумину ОКА и ЭКА сни­зились с 50,0±3,8 и 43,0±2,16 г/л до 24,5±1,52 и 18,3±1,37 г/л соответственно, что состави­ло достоверное уменьшение почти на 100%. Также было зарегистрировано уменьшение времени выживания парамеций с 21,6±0,35 до 4,21±0,19 минут

Снижение ЭКА ведет к повышению коэф­фициента токсичности. В качестве показателя уровня эндогенной интоксикации использовал­ся ИТ, рассчитанный по соотношению содержа­ния ОКА к концентрации ЭКА, рассчитанный по формуле:

ИТ = СМП/ЭКА х 1000

Причем биохимические показатели плазмы крови у больных в разной степени инток­сикации имели значительные достоверные различия (Р<0,01).

Было установлено, что индекс токсичности у больных эндотоксикозами возрастает более чем на 700%, по сравнению с контролем. По нашим данным, уровень Ит в острую фазу заболевания повысился в 7 раз.

Показатели летальности больных эндотоксикозами представлены в табл. 3.

Таким образом, на основании проведен­ных исследований можно сделать следующее заключение. У больных эндотоксикозами происходят интенсификация ПОЛ и угнете­ние иммунитета, снижение антиоксидантной защиты и детоксикационной способности ор­ганизма. Это свидетельствует, что на ранних стадиях эндогенной интоксикации уровень средне молекулярных пептидов (СМП) воз­растает по сравнению с нормой в среднем на 20-30%, на средней стадии — на 100-200 %, поздних — на 300-400 %, что хорошо согласу­ется с литературными данными.

Используя математический метод и ме­тод квадратов нами были вычислены коэф­фициенты корреляции и проведён анализ корреляционных связей между изменения­ми индекса интоксикации (ИИ) организма больных эндотоксикозами и изменениями показателей токсичности основных маркеров интоксикации. Рассчитанные коэффициенты

Таблица 3

Показатели летальности больных эндотоксикозами

 

Показатели:	I степень ЭИ		II степень ЭИ		III степень ЭИ		Всего
	кол-во больных	кол-во умерших	кол-во больных	кол-во умерших	кол-во больных	кол-во умерших	умерших
ОПН (n=78)	14	0 (0%)	26	8 (21,05%)	38	17 (44,7%)	25 (32,05%)
Перитонит (n=64)	8	0 (0%)	16	3 (18,75%)	40	13 (32,5%)	16 (25,0%)
Сепсис (n=41)	6	0 (0%)	12	3 (25,0%)	23	9 (39,1%)	12 (29,3%)
ВСЕГО: (n=183)	28	0 (0%)	54	14 (25,9%)	101	39 (38,6%)	53 (28,96%)

корреляции исследованных нами маркеров токсичных компонентов крови больных эндотоксикозами составил величины г = от 0,9 до 0,99.

При этом выявленные корреляционные связи трактовались как:

> сильная прямая корреляционная связь между показателями мочевины, креатинина,

МДА, СОД, МСМ, НТ, ЦИК и степенью ин­токсикации организма /г > 0,9/;

> сильная обратная корреляционная связь между показателями ОКА, ЭКА, временем жиз­ни парамеций (ПМ) и степенью интоксикации организма /г > 0,9/.

Результаты гельхроматографического метода исследования. Разработка молекулярно-генетических методов диагностики хотя частично и снизила интерес к биохимическим исследованиям, но вскоре стало ясно, что в большинстве случаев указанные методы дополняют друг друга, поскольку молекулярно-генетически описывается генотип, а биохимически — фенотип. Болезнь — это, в конечном счете, фенотип. В связи с этим, не­смотря на сложность, а иногда и дороговизну биохимических методов, им принадлежит ведущая роль в диагностике заболеваний. Современные высокоточные технологии, к ка­ким относится высокоэффективная гель-хро­матография, имеют с своём арсенале большие возможности и позволяют идентифицировать практически любые патологии.

Это обусловлено тем, что современный арсенал хроматографических технологий чрезвычайно широк и позволяет эффек­тивно и информативно разделять сложные многокомпонентные смеси, к которым в том числе относится и биологический ма­териал.

В основе метода гель-хроматографии лежит принцип разделения смеси веществ по их молекулярным массам, где молекулы веществ разделяются по размеру за счет их различной способности проникать в поры сорбента (геля). Если молекулам анализи­руемого вещества недоступны эти поры, то соответствующее соединение выйдет из колонки раньше, чем то, у которого размеры молекул меньше. Каждый пик на хроматограмме характеризуется временем удерживания и площадью.

Гель-хроматографию проводили на ко­лонке (40х1,6 см), заполненной поливини­ловым гелем, дающим линейное распреде­ление полипептидных молекул в диапазоне молекулярных масс (ММ) от 10 000 до 100 Да. В колонку вводили 0,1-0,15 мл цельной плазмы; в качестве элюента использовали фосфатно-солевой буфер (-0,02 Na 2HPO4 моль/л, рН 7,0 с содержанием 0,1 моль/л NaCl и 0,1 моль/л мочевины). Разделенные фракции регистрировали на выходе из ко­лонки УФ-монитором ("2238-Uvicord S II", LKB) при длине волны 254 нм. Оптический сигнал записывали в виде хроматограмм на двухканальном самопишущем потенци­ометре ("2210 Recorder", LKB), что давало возможность получения их записи в двух масштабах: при 100- и 40-кратном увели­чении чувствительности регистрирующего прибора. Колонку калибровали стандартны­ми пептидами с известной мол. м. (инсулин -6000 Да; инсулин b-цепь — 3496 Да; инсулин b-цепь — 2532Да; соматостатин — 1638 Да). После хроматографирования стандартов строили график зависимости объема элюирования (V R) и логарифма ММ, по кото­рому определяли среднюю мол. м. фракций пептидов плазмы крови (табл. 4).

Типичная хроматограмма плазмы крови здорового донора (а) и больного эндотоксико-зом (б) представлена на рис. 10.

Таблица 4

Содержание МСМ в плазме крови больных эндотоксикозами, %

 

 

Группа обследованных	МСМ, % от общего белка	Фракции пептидов
		А 4	В	В1	С		Т		в
Контроль	5,3±0,8	0,8 ± 0,03	11,0± 0,9	6,0± 0,7	57,1± 2,3	14,7± 2,5	1,5± 0,20	1,4± 0,23	7,5± 0,91
Перитонит	9,1± 0,7	3,0± 0,6	13,4± 0,8	4,5± 0,7	51,8± 2,0	23,7± 1,8	2,2± 0,7	12,1± 0,8	6,2± 0,7
ОПН	9,6± 0,5	3,6± 0,2	12,4± 0,9	5,5± 0,5	59,4± 3,0	25,5± 1,7	2,5± 0,3	12,1± 0,2	6,7± 0,3
Сепсис	8,3± 0,8	2,3± 0,3	11,4± 0,9	7,2± 0,5	56,7± 3,5	22,5± 1,3	1,6± 0,5	3,2± 0,8	6,7± 0,7

Примечание: достоверность Р>0,05.

Рис. 10. Типичная хроматограмма плазмы крови здорового донора (а) и больного эндотоксикозом (б)

Сравнение кривых фракционирования плазмы крови при эндотоксикозах и у здоро­вых лиц показало, что у больных эндотоксикозами происходит значительное увеличение фракций А (с ММ> 7600 и 5100 Да), фракции Б (с ММ А 4 3100 Да), фракции Б (с ММ 2600 Да) и в меньшей степени фракции В (с ММ 4200 Да). При этом наблюдалась тен­денция (р>0,05) к снижению в крови уровня МСМ с ММ 3700 и 2400 Да. Следовательно, при развитии эндотоксикоза в плазме крови происходит определенное концентрационное перераспределение МСМ, которое может быть характерным только для данного вида патологии.

Таким образом, наблюдается определен­ный параллелизм между накоплением МСМ в крови больных эндотоксикозом и индукцией процессов ПОЛ, которые могут быть факто­ром генерации МСМ.

На основании проведенных исследований можно сделать вывод, что накопление МСМ определенных классов в крови при эндотоксикозах связано с параллельно протекающи­ми процессами ПОЛ, которые определяют глубину вторичных патохимических измене­ний в структуре крови. Это следует учиты­вать при разработке методов интоксикации и оценке прогноза заболевания.

Результаты применения метода ИК-спектрометрии для диагностики эндотоксикозов. Одним из методов диагностики заболеваний является ИК-спектроскопия крови, имеющая значительные преимущества перед вышеуказан­ными методами исследований. Кровь содержит всю информацию о состоянии организма до абсолюта: обо всех болезнях, которыми человек страдает в настоящее время, о когда-то перене­сенных заболеваниях и о вероятности возник­новения нового патологического процесса" [9].

Поэтому исследования спектральных ха­рактеристик крови больных эндотоксикозами на разных стадиях заболевания методом ИК-спектроскопии представляют большой научный и практический интерес.

Широкое применение ИК-спектроскопии в медицине обосновывается тем, что при диагностике биологические субстраты (ткань или жидкость) больного человека отличаются по своему составу от соответ­ствующих биосубстратов здорового. Для каждой патологии характерно определенное нарушение метаболизма, отличающееся от других патологий. Следовательно, для ка­ждой патологии должен быть свой уникаль­ный количественный и качественный состав биосубстрата, а значит, отличающийся по форме, интенсивности и положению частоты максимума полосы поглощения в ИК области частот [9].

Современные методы молекулярной спек­троскопии позволяют, не разлагая вещество, проводить его идентификацию, установить состав, определить присутствие различных групп и связей, свободных радикалов, иссле­довать меж- и внутримолекулярные взаимо­действия и др. ИК-спектроскопия использу­ется для качественного и количественного исследования состава плазмы крови, который определяется по преобладанию характерных полос поглощения отдельных функциональ­ных групп [9].

ИК-спектроскопия является высокоинфор­мативным методом для определения коли­чественно-качественных изменений состава исследуемых биосубстратов на молекулярном уровне. Это явилось основанием использова­ния метода ИК-спектроскопии для исследо­вания крови и её токсичных компонентов с целью улучшения диагностики эндотоксико-зов в комплексе с традиционными методами исследования.

Для записи ИК спектров был использо­ван метод получения тонкой пленки из 1-2 капель плазмы, нанесенных на поверхности оптических подложек. Затем регистрируются ИК — спектры образовавшейся тонкой пленки в спектральном диапазоне частот 400-4000 см-1. Спектры регистрировались на стандартном двухлучевом спектрофотометре «СОКБ8РБ -75 Ж». Выбор оптимальных условий во время записи ИК — спектров позволил определить ширину полос и частоту максимума с точно­стью 1,0 см-1.

Типичные ИК-спектры плазмы крови больных эндотоксикозами начальной стадии и терминальной стадии, образовавшийся в результате перитонита от острой кишечной непроходимости, и практически здоровых доноров представлены на рис. 11.

Рис. 11. ИК-спектры плазмы крови больных эндотоксикозами.

1 — контрольная группа; 2 — I степень эндотоксикоза; 3 — III степень эндотоксикоза.

Как видно из рисунка, спектры существен­но отличаются друг от друга по форме, ин­тенсивности, положению частоты максимума отдельных полос, а также по интегральной интенсивности. При III степени эндотокси-коза (крив. 3), в области частот 3600 — 2500 см-1 проявляется широкая полоса с частотой максимумом (νмакс.) 3230 см-1, относящаяся к валентными колебаниями —ОН и — групп, а слабая полоса в области частот 2960­2820 см-1 относится к валентным колебани­ям связи —СН. У больных при начальной стадии эндотоксикоза (крив. 2), происходит сильное увеличении интенсивности слабой полосы с νмакс._. 2920 см-1 и общей интенсивности полосы проявляющейся в области частот 3600 – 2500 см-1. Более сильные изменения в данной области частот наблюдается в спектрах контрольной группы (практически здоровых доноров), где происходит сильное увеличение интенсивности полосы с νмакс. 2920 см-1 и перекрывает полосу 3230 см-1, при этом наблюдается общее уменьшения интенсивности полос.

Для ИК-полос поглощение, проявляющееся в области частоте 1800 – 400 см-1, также наблюдаются существенные изменения форм, положения νмакс. и изменение интенсивностей. При III степени эндотоксикоза в области частот 1660 – 1360 см-1 наблюдаются интенсивные полосы с νмакс. 1632 и 1520 см-1 и следы двух слабых пиков. У больных контрольной группы и с I степенью эндотоксикоза происходит слияние полос с νмакс. 1632 и 1520 см-1 и сильное увеличение  интенсивности очень слабой полосы при 1435 см-1.

Для достоверной интерпретации вновь полученные ИК-спектры плазмы крови впер­вые поступивших больных сопоставляются с эталонным ИК-спектрами, в качестве ко­торых использовали спектры плазмы крови больных, которым по известным критериям в медицинской практике достоверно был установлен диагноз эндотоксикоз, что было подтверждено при сопоставлении результатов ИК-спектроскопии с другими общеприняты­ми методами исследования.

Сравнительная оценка исследованных методов диагностики. Проведённый анализ биохимических, гель-хроматографических и ИК-спектроскопических методов исследова­ния токсичных компонентов крови больных эндотоксикозами показал, что все анализиро­ванные методы имеют в своём арсенале как много положительных сторон, так и некото­рые недостатки.

Так, биохимический метод исследования позволяет получать большой объём очень важной и необходимой информации о всех изменениях, которые происходят в составе исследуемого биологического материала, в частности в крови и её компонентах. К основным недостатками метода можно от­нести: травматичность, трудоёмкость, дол-госрочность, необходимость использования самых разнообразных реактивов, химикатов и инвентаря, оборудования, существование большого количества разнообразных методов исследования, присутствие ошибки человече­ского фактора и другое.

Метод гель-хроматографии хоть и является высокоэффективным и способным в колонке разделять по молекулярной массе все компо­ненты на различные фракции и регистриро­вать их в виде хроматограммы и, достаточно не сопоставляя пики отдельных фракций, только оценивать их площадь. Несмотря на все достоинства метода гель-хроматографии, он практически недоступен, так как требует применения дорогостоящего оборудования, разнообразных реактивов, химикатов и спе­циального лабораторного инвентаря. Метод очень трудоёмкий и неоперативный.

Наиболее оперативным, нетравматич­ным, наглядным и информативным является метод молекулярной ИК-спектроскопии. Его преимущества заключаются в следую­щем:

• для диагностики достаточно 1-2 капли плазмы крови больных;

• для записи ИК-спектра не требуются хи­мические реактивы;

• по результатам исследования ИК-спектров плазмы крови в динамике можно до­стоверно оценивать степень интоксикации организма и эффективность курса проводи­мого лечения;

• метод ИК-спектроскопии прост, досту­пен, оперативен и экономичен.

К недостаткам метода можно отнести не­обходимость наличия полной базы данных (достоверных эталонов) разных нозологи­ческих патологий (от нормы до всех стадий разнообразных изменений основных показа­телей состояния организма) для сравнения.

Заключение

На основании проведённых исследований можно заключить, что в настоящее время наиболее целесообразным при диагностике эндотоксикозов на ранних стадиях заболева­ния считается дополнение традиционных био­химических исследований данными анализа и интерпретацией ИК-спектров крови больных. Это позволит своевременно распознать нача­ло патологических процессов в организме, когда временной фактор играет решающую роль в установлении диагноза, определении тактики лечения, прогнозировании исходов и снижении летальности.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов

ЛИТЕРАТУРА

1. Александрова Е.Н., Новиков А.А., На­сонов Е.Л. Высокочувствительные методы определения С-реактивного белка // Клин. лаб. диаг. 2004. № 11. С. 16-18.

2. Афанасьева А.Н. Сравнительная оцен­ка уровня эндогенной интоксикации у лиц разных возрастных групп // Клин. лаб. диаг. 2004. № 6. С. 11-13.

3. Генетический паспорт — основа инди­видуальной предиктивной медицины / под ред. В.С. Баранова. СПб.: Изд-во Н-Л, 2009. 527 с.

4. Зубриянова Н.С., Дмитриев А.П. Ме­тоды изучения корреляционных связей: учебно-методическое пособие. Пенза: ПТУ, 2005. 56 с.

5. Карякина Е.В., Белова СВ. Молекулы средней массы как интегральный показа­тель метаболических нарушений (обзор литературы) // Клин. лаб. диаг. 2004. №3. С. 4-8.

6. Малахова М.Я. Эндогенная интокси­кация как отражение компенсаторной пере­стройки обменных процессов в организме. // эфферент. тер. 2000. №4. С.10-16.

7. Свердлов Е.Д. Взгляд на жизнь через окно генома: Т. 1. Очерки структурной молекулярной генетики. М.: Наука, 2009. 525 с.

8. Шукуров Т., Сафаров А.М., Вахидов А.В. Применение лазеротерапии у больных с острой непроходимостью кишечника ослож­нившейся перитонитом. // VII международная научная конференция «Лазерная физика и оптические технологии». Минск, 2008. Том II. С.372-375.

9. Юдакова О.В., Григорьев Е.В. Интен­сивность ПОЛ и АОА, уровень молекул средней массы как показателя эндогенной интоксикации при распространенном пе­ритоните // Клин. лаб. диаг. 2004. № 10. С. 20-22.

REFERENCES

1. Aleksandrova E.N., Novikov A.A., Naso-nov E.L. Highly sensibility methods of the deter­mination С-reactive protein. Clinical Diagnostic Laboratory, 2004, No.11, pp. 16-18.

2. Afanas'eva A.N. The comparative estimation level endogenic intoxication in persons of the dif­ferent age groups.Clinical Diagnostic Laboratory, 2004. No. 6, pp. 11-13.

3. Geneticheskiy pasport — osnova individ-ual'noy prediktivnoy meditsiny / pod red. V.S. Baranova [Genetic passport — a base individual predictive medicine / Edited by. V.S. Baranova]. St. Peterburg, N-L Publ., 2009. 527 p.

4. Zubriyanova N.S., Dmitriev A.P. Metody izucheniya korrelyacionnykh svyazey: ucheb-no-metodicheskoe posobie [Methods of the re­search correlation brace: scholastic-methodical allowance]. Penza, PTU Publ., 2005. 56 p.

5. Karyakina E.V., Belova SV. The Molecules of the average mass as integral factor of the met­abolic breaches (the review of the literature).Clin-ical Diagnostic Laboratory, 2004, no. 3, pp. 4-8.

6. Malahova M.Ya. Endogen intoxication as reflection compensational realignments of the change processes in organism.Efferent therapy, 2000, no.4, pp.10-16.

7. Sverdlov E.D. Vzglyad na zhizn' cherez okno genoma: T. 1. Ocherki strukturnoy molekulyar-noy genetiki [The Look at life through genome window: T. 1. The Essays structured molecular geneticists]. Moscow, Nauka Publ., 2009. 525 p.

8. Shukurov T., Safarov A.M., Vahidov A.V. [Lazer physics and optical technologies] Primenenie lazeroterapii u bol’nykh ostroy ne-prohodimost’yu kishechnika oslozhnivsheysya peritonitom. VII mezhdunarodnaya nauchnaya [Using lazer therapy in patients with sharp impass-ability of the intestine by complicated peritonitis VII international scientific conference]. Minsk, 2008, Vol. 2, pp.372-375.

9. Judakova O.V., Grigor'ev E.V. The Inten­sity FLOOR and AOA, level of the molecules of the average mass as factor endogen intoxication under wide-spread peritonitis Clinical Diagnostic Laboratory, 2004, no. 10, pp. 20-22.

Сведения об авторах:

Мурадов Алишер Мухтарович — заве­дующий кафедрой эфферентной медицины и интенсивной терапии ТИППМК, д.м.н., профессор; тел: (+992) 900 730110; e-mail: alishermuradov@mail.ru

Information about the authors:

Muradov Alisher Mukhtarovich — the chair of department of efferent medicine and intensive therapy TIPGPMP, Dr. med. sci., professor; Tel: (+992) 900730110; e-mail: alishermuradov@mail.ru

.